Attune®NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀采用了模塊設(shè)計(jì)，能夠配置至多4種激光和14色熒光檢測(cè)，適用于多參數(shù)分析 (圖1)，可滿(mǎn)足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)室預(yù)算要求。Attune® NxT流式細(xì)胞儀能夠兼容流式細(xì)胞儀中的熒光基團(tuán)和熒光蛋白，可以與您目前運(yùn)行的檢測(cè)板匹配 (表1)。采用可選的561 nm激光還可檢測(cè)多種熒光蛋白 (圖2)。



圖1. 采用Attune®NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀對(duì)小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù) (10色) 分析。 采用FSC/SSC參數(shù) (A，左) 對(duì)淋巴細(xì)胞設(shè)門(mén)，在后續(xù)分析中除去表達(dá)B220的B細(xì)胞 (A，中)。在B220–、CD45.2+設(shè)門(mén)范圍內(nèi)，根據(jù)CD3表達(dá)水平分析T細(xì)胞 (A，右)。根據(jù)輔助受體CD4或CD8 (B，左) 的表達(dá)水平將CD3+ T細(xì)胞分成兩個(gè)群體。在CD4+ T細(xì)胞中，有一種抑制性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群可以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和細(xì)胞表面標(biāo)記物CD25 (IL-2Rα) (B，右)。.CD3–細(xì)胞中有少量CD11c+ MHCII+群體，它們是專(zhuān)業(yè)的抗原提呈樹(shù)突狀細(xì)胞(C，左)。脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞可以進(jìn)一步分為CD11b+和CD8+樹(shù)突狀細(xì)胞亞群 (C，右)，分別具有不同的抗原提呈特性。
 

圖2. 活細(xì)胞熒光蛋白檢測(cè)。 采用CellLight®細(xì)胞核-GFP (貨號(hào)：C10602) 和CellLight®質(zhì)膜-RFP (貨號(hào)：C10608) 同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)U-2 OS細(xì)胞。采用Attune®NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞，儀器使用488 nm激光和530/30發(fā)射濾光片及561 nm激光和585/16 nm發(fā)射濾光片。

表1. Attune® NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀熒光基團(tuán)選擇指南。

*不包括適用于PE的黃色激光 (590/40)。
**可以任選各色激光進(jìn)行側(cè)向散射分析(默認(rèn)為藍(lán)色激光)。紫色激光側(cè)向散射推薦用于無(wú)洗脫/裂解應(yīng)用。

Attune®NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀可以在您需要時(shí)提供更高的靈敏度。即便是在1,000 μL/分鐘的高進(jìn)樣速率下，您也可以維持精確的聚焦。聲波聚焦提供的精確聚焦使研究人員能夠獲得更小的CV值，更好地鑒別模糊信號(hào)和背景，從而減少差異，改善信號(hào)分離效果 (圖3)。
 

圖3. 不同流速下的靈敏度檢測(cè)。在(A) 的傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀和(B和C) Attune®NxT聲波聚焦細(xì)胞分析儀上，采用561 nm激光和(A) 610/20或(B和C) 610/15發(fā)射濾光片，運(yùn)行熒光微球 (Spherotech Rainbow校準(zhǔn)微粒，3.2 μm)。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀是在的靈敏度設(shè)置下運(yùn)行 (~12.5 μL/分鐘)。Attune® NxT流式細(xì)胞儀采用了2種不同的設(shè)置運(yùn)行：(B) 12.5 μL/分鐘，與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀相同，以及 (C) 500 μL/分鐘，進(jìn)樣量高40x。即便是在流速下，Attune® NxT流式細(xì)胞儀亦可提供相當(dāng)或更佳的結(jié)果。

細(xì)胞周期分析是必須精確檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞群體之間的熒光強(qiáng)度差異的實(shí)例之一。采用Attune®NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀，不論樣本進(jìn)樣速率如何變化，都可以地減小結(jié)果的差異。您無(wú)需再通過(guò)放棄通量而獲得靈敏度 (圖4)。

圖4. 采用Attune®NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀，可在高進(jìn)樣速率下地減小數(shù)據(jù)差異。 對(duì)Jurkat細(xì)胞進(jìn)行固定，RNA酶處理，并用碘化丙啶（PI）染色，制成濃度為1 x 106個(gè)細(xì)胞/mL的溶液，以不同的進(jìn)樣速率在Attune® NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。所有圖上左側(cè)的峰反映G0/G1期的細(xì)胞，右側(cè)的峰反映G2/M期的細(xì)胞。不論進(jìn)樣速率如何，Attune® NxT流式細(xì)胞儀上G0/G1和G2/M峰的寬度以及CV%都很穩(wěn)定，即便是在1,000 μL/分鐘的進(jìn)樣速率下也是如此。

少量細(xì)胞群體的分析需要多次采集才能獲得準(zhǔn)確且值得信賴(lài)的結(jié)果，這導(dǎo)致其采集時(shí)間較長(zhǎng)。Attune® NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀的樣本運(yùn)行速率比其他流式細(xì)胞儀快10倍——達(dá)1,000 μL/分鐘，每次運(yùn)行能采集2 x 107次，可以快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)稀有細(xì)胞，且不影響數(shù)據(jù)質(zhì)量 (圖5)。

圖5. >100萬(wàn)活細(xì)胞的采集和少量 (0.2%) 樹(shù)突狀細(xì)胞群的檢測(cè)。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞 (pDCs) 是一種特殊的細(xì)胞群，它們?cè)诓《镜拇碳は驴僧a(chǎn)生大量的I型干擾素，可根據(jù)免疫表型CD19–/B220高/CD317+進(jìn)行鑒定。利用CD19-Pacific Blue™、CD317-Alexa Fluor® 488、CD45R/B220-PE直標(biāo)抗體以及SYTOX® AADvanced™ 死細(xì)胞染料對(duì)小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行四色染色。采用SYTOX®AADvanced™ 死細(xì)胞染料在活細(xì)胞中設(shè)門(mén)，然后在CD19–細(xì)胞中設(shè)門(mén)。采用CD45R/B220與CD317雙參數(shù)曲線(xiàn)鑒定pDC。利用500 μL/分鐘的采集速度，獲得130萬(wàn)個(gè)總細(xì)胞，細(xì)胞濃度為7.5 x 107個(gè)細(xì)胞/mL。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞被鑒定為雙B220+/CD317+ (右上象限)，占CD19–活細(xì)胞的0.851%，全部脾細(xì)胞的0.194%。

洗脫并裂解紅細(xì)胞 (RBC) 會(huì)造成嚴(yán)重的細(xì)胞損失和損傷。的樣本采集速率使得Attune® NxT流式細(xì)胞儀能夠提供無(wú)需洗脫/裂解的實(shí)驗(yàn)方案，地避免了細(xì)胞損失，簡(jiǎn)化了樣本制備 (圖6)。該特性尤其適用于那些濃度較低的樣本，諸如腦脊液 (CSF)、干細(xì)胞及細(xì)胞數(shù)量較少的稀釋樣本，這些樣品分析的采集時(shí)間通常較長(zhǎng)。采用Attune® NxT流式細(xì)胞儀，即便是稀釋樣本，亦可快速采集，且不影響數(shù)據(jù)質(zhì)量?？梢詫?duì)諸如小鼠血液和骨髓等難以采集的樣本、細(xì)針抽吸樣本或低細(xì)胞產(chǎn)量的樣本直接進(jìn)行熒光標(biāo)記然后稀釋進(jìn)樣，無(wú)需洗脫或進(jìn)行紅細(xì)胞裂解。在高樣本采集速率下可輕松實(shí)現(xiàn)采集——您可在四分鐘內(nèi)運(yùn)行至多4 mL樣本。這種樣本制備過(guò)程不會(huì)出現(xiàn)樣本損失，且可對(duì)所有珍貴樣本進(jìn)行全面檢測(cè)。



圖6. 無(wú)需樣本制備，且不影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。采用抗體染色五微升全血，孵育，并使用4 mL緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)贏ttune®NxT流式細(xì)胞儀上分析。紅細(xì)胞可以吸收405 nm光線(xiàn)，可實(shí)現(xiàn)如中圖所示的側(cè)向散射的差異化設(shè)門(mén)，在該圖中，采用405 nm與488 nm側(cè)向散射雙參數(shù)曲線(xiàn)區(qū)分白細(xì)胞和紅細(xì)胞群體。在該群體中，可采用前向散射與側(cè)向散射子曲線(xiàn)圖鑒別淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞群體，無(wú)需熒光標(biāo)示。

Attune®NxT軟件采用直觀且易于使用的界面，能提供強(qiáng)大的數(shù)據(jù)采集和分析功能 (圖7)。您可以方便地建立、自定義并保存實(shí)驗(yàn)供將來(lái)研究之用。自動(dòng)進(jìn)行補(bǔ)償，并可根據(jù)補(bǔ)償指南進(jìn)行設(shè)置。

分析軟件為數(shù)據(jù)分析大化設(shè)計(jì)，其對(duì)較大的數(shù)據(jù)組的刷新速度快 (高達(dá)2,000萬(wàn)次/樣本)，當(dāng)您作出調(diào)整時(shí)，能夠立即顯示于數(shù)據(jù)曲線(xiàn)上。軟件采用的工具簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)設(shè)置，包括利用濾光片配置管理器進(jìn)行試劑選擇。您可以從預(yù)置或定制試劑下拉菜單中選擇試劑，根據(jù)儀器上的優(yōu)化通道匹配適當(dāng)?shù)脑噭?，然后?yīng)用于曲線(xiàn)標(biāo)志。

圖7. Attune® NxT軟件界面。

Attune® 聲波聚焦細(xì)胞分析儀只能用于實(shí)驗(yàn)研究 不得用于人或動(dòng)物的治療或診斷用途。