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定量PCR還是數(shù)字PCR

隨著數(shù)字PCR技術(shù)應用的展開，越來越多實驗室被其絕對定量的方式、結(jié)果的高靈敏度、高重復性等特質(zhì)所吸引。2012年年底，由Frost & Sullivan公司在北美市場進行的調(diào)研顯示，約三分之一的被訪者表示會考慮購買數(shù)字PCR設備。

那么，是否意味著目前在研究、臨床和工業(yè)領域內(nèi)，廣泛采用的熒光定量PCR技術(shù)將被淘汰？數(shù)字PCR很快就要將其徹di取代？越來越多實驗室對陳斯卡提出類似問題。結(jié)合多年推廣定量PCR與近幾年投身數(shù)字PCR領域的經(jīng)驗心得，陳斯卡談談自己的體會，供大家參考。

陳斯卡總體的觀點是：雖然絕大多數(shù)定量PCR的應用都可以使用數(shù)字PCR完成，但在可預期的將來，兩者將長期共存。到底使用定量PCR還是數(shù)字PCR，取決于具體應用和對數(shù)據(jù)的要求。兩者不是either/or的關(guān)系，而是both/and的關(guān)系。兩種技術(shù)平臺各自的特點與現(xiàn)狀大致可從下面8個方面說明。

1.   在20多年的使用和發(fā)展中，定量PCR作為一種技術(shù)平臺，已經(jīng)產(chǎn)出海量的數(shù)據(jù)，在工業(yè)界和分子檢測的某些應用上，定量PCR已經(jīng)成為“金標準"?；A研究方面，則形成了被稱為MIQE的“定量PCR標準實驗指南"。

2.   在定量PCR的各種應用中，基因表達分析（gene expression analysis）的應用比重約占七成，綜合各種因素來看，眼下定量PCR還是進行基因表達研究的理想手段。

3.   上述的“各種因素"具體展開，主要包括：通量、自動化程度、各種檢測探針與染料、檢測通道、成本和可參考文獻與protocol的數(shù)目等等。

4.   就目前市場上已有的數(shù)字PCR設備來看，定量PCR在檢測的線性范圍上具有優(yōu)勢，意味著同一個run內(nèi)可對各種表達豐度的樣品進行分析。

5.   目前定量PCR已經(jīng)能實現(xiàn)高通量樣品條件下的自動化操作。

6.   數(shù)字PCR在單分子層面上的絕對定量，可以徹di擺脫對標準曲線的依賴而直接給出靶序列的拷貝數(shù)，提高了實驗結(jié)果在批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性，甚至能用來對標準品進行定標。

7.   基于絕對定量的方式，數(shù)字PCR結(jié)果的高重復性和高精度可實現(xiàn)微小差異的基因表達分析，如等位基因的不平衡表達、單細胞基因表達分析、microRNA表達分析等等。所謂“微小差異"的標準一般而言是指表達水平的差異在2倍以內(nèi)。

8.   同等條件下，數(shù)字PCR在靈敏度方面擁有優(yōu)勢，使得該技術(shù)已成為腫瘤的液態(tài)活檢、病原微生物檢測、轉(zhuǎn)基因成分測定、宿主殘留DNA分析等的熱門技術(shù)。